反相色譜柱中污染物是怎樣的形成？

1.色譜柱固定相的表面特征

大部分用于反相色譜的固定相是疏水性的，因此分析物是通過其與固定相之間的疏水作用的程度來進(jìn)行分離的，含有疏水性組成的基團(tuán)也有相似的保留行為。

殘余的硅羥基存在于所有的硅膠鍵合相的表面。由于是弱酸的特性，這些硅羥基會同某些分析物相互作用，尤其是同一些堿性化合物。因為硅羥基的Pka值大約是在4.5左右。

同時，硅膠鍵合相的表面還會殘留有金屬離子，這些金屬離子會在硅膠表面提供更強的酸性，同樣還會起金屬螯合作用使化合物保留變大。

大家可能會疑惑，金屬離子的存在為什么會導(dǎo)致化合物的保留變大呢？

首先因為硅膠表面的金屬離子會起鰲合作用，這樣容易導(dǎo)致含有多個極性基團(tuán)的化合物分子保留值變大。其次，靠近表面的金屬離子會激活硅醇基團(tuán)，使得硅醇基更容易和酸性或堿性化合物相互作用，從而導(dǎo)致化合物保留值增大、色譜峰拖尾。

2.色譜柱污染物的來源

色譜柱的使用者必須清楚色譜柱固定相的表面特征和可能存在的分析物與固定相表面發(fā)生的相互作用。

通常，樣品基質(zhì)里總是含有一些對分析者來說不感興趣的化合物，例如鹽類、脂質(zhì)、含脂肪的化合物、疏水性的蛋白質(zhì)和其他的一些生物化合物。它們可以通過檢測器觀察到，它表現(xiàn)為一些色譜峰、基線干擾，甚至是一些倒峰。

這些物質(zhì)可能會比所需分析的物質(zhì)有更強或更弱的保留能力。那些保留能力比較弱的化合物如鹽類，將以死體積被洗脫出來。

如果樣品基質(zhì)組成在色譜柱中有強的保留性，且流動相組成本身就不強到足以使其洗脫出來，這些被吸附的、或是被吸收的化合物將會累積，通常是在經(jīng)過多次進(jìn)樣之后堵塞在色譜柱的柱頭。 

這些吸附的樣品組成達(dá)到了比較高的濃度，它們便表現(xiàn)為一種新的固定相。被分析物可與這些雜質(zhì)作用并表現(xiàn)為新的分離機(jī)理。它可能會引起保留時間的變化和峰的拖尾。如果色譜柱受到了比較嚴(yán)重的污染，色譜柱的壓力會達(dá)到一個無法承受的高度，這將會使泵超壓工作，在堵塞的位置引起柱頭的塌陷。

還有另一個情況需要注意，污染物并非來自樣品或流動相，有可能來自儀器的密封圈碎屑。這些碎屑會隨著流動相進(jìn)入色譜柱，導(dǎo)致色譜柱堵塞。

3.定期清洗污染的反相色譜柱

清洗污染的反相色譜柱的頻率依懶于有多少不明物質(zhì)被注射到柱子中，因為反相色譜柱有時在分辨率損失和外來物質(zhì)的洗脫前可以忍受大量的污染物, 使用者往往等到他們觀察到一些異常現(xiàn)象才對柱子進(jìn)行清洗。然而，長時間累積的污染物會使色譜柱的清洗工作變得更難。正因為如此，如果你知道自己的色譜柱很容易受到臟的樣品基體的污染時，建議定期清洗你的色譜柱。清洗的次數(shù)越多，清洗條件也就越簡單。

4.防止污染物進(jìn)入色譜柱

最好的解決方法是預(yù)防，您將來可能會考慮使用在線過濾器或更佳的保護(hù)柱來保護(hù)分析柱。如果問題的根源是樣品本身，則可以考慮對樣品進(jìn)行過濾或使用固相萃取去除污染物。

在線過濾器只是對色譜柱部分保護(hù)，他們有助于去除流動相中的顆粒物。顆粒來源于您的樣品或者HPLC儀器的零部件。在線過濾器無法保護(hù)色譜柱免受小于過濾器的物質(zhì)的污染，并可能吸附在填料表面。