總體策略 → 樣品前處理 → 分離手段選擇 → 色譜條件開發 → 分級/制備放大 → 鑒定與定量 → 方法驗證與質量控制 → 常見問題與解決”來組織，便于在實際實驗室中操作與決策。

一、總體策略（先明確目標）

明確研究目的：定性（成分鑒定）、定量（指標成分含量）、指紋圖譜、分離純化（制備）或活性導向分離。

明確目標化合物類別（生物堿、黃酮、皂苷、苷類、揮發油、多糖等）及其理化特性：極性、酸堿性、揮發性、熱穩定性、紫外吸收/電離能力。

依據目標和樣品基質制定分離路線：先“粗分級（溶劑分配/液液分配/SPE）→ 中間分離（柱色譜/開柱、CC）→ 精制（制備HPLC/CCC）→ 鑒定（LC-MS, NMR）”。

二、樣品前處理（關鍵，影響后續分離）

原料粉碎并過篩，記錄批次；控制水分避免發霉。

提取選擇：依據目標化合物極性選溶劑（揮發油：蒸餾或有機溶劑/SPME；中等極性成分：70%MeOH、EtOH；極極性：水或水提）；可先做小規模單因素試驗比較提取率。

粗提/分級：經常使用溶劑漸進提取或溶劑分配（如水提后用石油醚/乙酸乙酯/n-BuOH分層）把樣物按極性分級，簡化后續工作量。

去除脂溶雜質：若含蠟/脂多，先用石油醚或正己烷脫脂。

固相萃?。⊿PE）：用于濃縮、去鹽或去色素，選擇C18、Si、PS-DVB、SCX/SAX等吸附劑按需。

過濾與稀釋：進樣前0.22–0.45 μm膜過濾，溶劑與流動相匹配（避免溶劑強度過高導致峰形差）。

三、分離手段選擇（按目標物理化學性質）

非揮發性小分子（黃酮、苷類、生物堿、皂苷等）：首選反相HPLC/UPLC（C18/C8）；對高度極性者可選HILIC；對強極性或高分子選離子色譜或尺寸排阻（SEC/HPGPC）。

揮發性成分（揮發油、萜類）：GC 或 GC-MS（前處理：蒸餾、SPME、溶劑萃取）。

強極性/無紫外吸收（多糖、極性寡糖）：HPGPC、離子交換或衍生化后用RP-HPLC；多糖用酶或色譜-化學法。

制備分離：中試/制備HPLC、逆流色譜（CPC/HPCCC）、硅膠柱色譜、Flash色譜等。逆流色譜對極性差異小的天然產物非常有效。

四、分析條件開發（以HPLC/UPLC為主）

固定相選擇

C18（通用首選），C8（較少保留）、Phenyl（芳香相互作用）、CN/Amide（弱極性或極性互補）、HILIC（強極性）。

流動相與pH控制

常用：乙腈-水或甲醇-水。為改善峰形、提高離子化或穩定性，加入揮發性酸/鹽（0.1%甲酸或乙酸、10 mM 甲酸銨/乙酸銨、5–20 mM 乙酸銨/碳酸銨）；用于堿性生物堿可加少量堿（0.01–0.05%三乙胺或碳酸氨），但對MS需選揮發性緩沖。pH對離子化化合物影響大，pH調節能顯著改變保留。

起始條件建議（常用分析柱 4.6×150 mm，5 μm）

黃酮/苷類：ACN/水 + 0.1%甲酸，梯度 5% → 60% ACN（30 min），流速 1.0 mL/min，λ 254/280 nm。

生物堿（堿性）: ACN/10 mM NH4HCO3 (pH ~9) 或 ACN/0.05% TEA（調整使堿性化合物呈中性或弱離子化），梯度 5%→60%（30 min），用UV或MS檢測。

皂苷（無強紫外）：MeOH/H2O 或 ACN/H2O，檢測用ELSD/CAD或MS；梯度 20%→90% ACN/MeOH（視樣品）。

多糖/極性小分子：HILIC（ACN高比例）或衍生后RP-HPLC。

檢測器

紫外/二極管陣列（DAD）：適合含共軛系統的化合物。

ELSD/CAD：適合無或弱UV吸收的皂苷、三萜類。

LC-MS/MS：用于跟蹤、鑒定和痕量定量（選擇正/負離子模式）。

方法開發流程（快速迭代）

先做試劑/溶劑相容性與柱選擇的 scouting（小樣色譜圖比較不同柱）。

選一兩種候選柱（C18、Phenyl、HILIC），用梯度掃描（短梯度如5→95% ACN 0–20 min）觀察成分分布。

優化梯度坡度、起始/終止有機相、流速、柱溫與pH以改善關鍵峰分離。

小心樣品溶劑強度對峰形的影響，必要時換溶劑或降低注入體積。

系統適用性指標（SST）

理論板數、尾峰因子、重復進樣RSD、分辨率（關鍵組分Rs>1.5）作為放行標準。

五、分級與制備放大策略

先用溶劑分配/液-liquid提取減低復雜度（可按極性連續分配：石油醚→乙酸乙酯→n-BuOH）。

對中等純度制備：硅膠柱/ODS開柱分離 → 收集粗分餾（按薄層/分析HPLC監測）。

需要較高純度：用制備HPLC或CPC/HPCCC（避免固定相吸附，適合洋蔥式分離）。

放大注意：放大不是線性按體積縮放（需按填料質量、表面積、線速度和載樣量重建條件）；對放大建議做中等放大試驗再全放大。

六、鑒定與定量

鑒定：LC-MS/MS（分子量、片段）、NMR（結構確認）、UV/IR 輔助。對未知峰，盡量獲得高分辨率MS與MS/MS。

定量：用外標法或內標法；對復雜基質建議用基質匹配標準曲線或標準加入法校正矩陣效應。

指紋/多成分定量：建立指紋圖譜并挑選若干指示峰作為質量控制（符合連續批次相似度）。

七、方法驗證（參照ICH與藥典） 必須評估：特異性/選擇性、線性、準確度（回收率）、精密度（重復性/中間精密）、LOD/LOQ、穩定性、魯棒性/范圍。對LC-MS還需評估基質效應與離子抑制。給出典型閾值：回收率 90–110%（可根據目標調整），RSD ≤2–5%（含量測定通常 ≤2%）。

八、常見問題與解決

峰拖尾：檢查pH（弱酸/堿被吸附）、使用競爭性洗脫劑、改用端胺化或低殘留硅膠柱、減少硅膠上羥基暴露（用TEA微堿或甲酸銨）。

峰分裂/寬峰：樣品溶劑太強、注入體積過大、體系外體積大（窄徑柱注意最小死體積）、柱污染。

分辨率不足：改變梯度斜率、降低流速提高理論板、換柱（更高效或不同選擇性）。

基線噪聲/漂移（ELSD/CAD）：流動相揮發性不一致或泵不穩定；對LC-MS基線噪聲檢查溶劑純度與脫氣。

含鹽/基質抑制LC-MS：用SPE或稀釋、改用其他離子化模式（APCI）、優化洗脫梯度減少基質共洗脫。

目標峰無UV吸收：改用ELSD/CAD或MS檢測，或化學衍生化賦予紫外/熒光性質。

九、質量控制與記錄

建立樣品前處理 SOP、色譜方法 SOP、系統適用性測試 SOP。

保存原始色譜數據、樣品制備記錄、對照品批次與純度證明。

對于常規質量控制可建立快速指紋或多指標準測定流程。

十、實用模板（示例起始條件）

黃酮/苷類分析（分析柱 4.6×150 mm, 5 μm）： 流動相 A：水 + 0.1% 甲酸；B：乙腈

梯度：5% B（0–2 min）→ 40% B（2–25 min）→ 95% B（25–28 min）→ 5% B 回平衡（28–35 min）

流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；檢測：DAD 254/280 nm。

生物堿分析（堿性）： A：10 mM NH4HCO3 (pH ~9)；B：乙腈

梯度 5→60% B（0–30 min），流速 1.0 mL/min，檢測 UV 或 MS（正離子模式）。

皂苷制備（ELSD/制備HPLC）： A：水；B：甲醇/乙腈混合（1:1）或純MeOH

梯度 20→90% B（0–40 min），檢測 ELSD，制備柱按填料放大。